实时荧光PCR试剂盒是分子诊断、病原检测、基因表达分析及食品安全监控的核心工具，其通过特异性引物、探针与高保真酶体系，在封闭管内实现核酸的扩增与荧光信号同步监测。操作看似简单，但污染防控、体系配制、程序设置等细节稍有疏忽，易导致假阳性、假阴性或扩增效率低下。规范使用
实时荧光PCR试剂盒，是获得可靠数据的前提。
一、实验前准备
分区操作：严格划分“试剂配制区—样本处理区—扩增区”，单向流动，禁止交叉；
耗材选择：使用无DNA/RNA酶、无PCR抑制物的低吸附带滤芯枪头与PCR管；
环境清洁：实验台面用10%次氯酸钠擦拭，再用75%乙醇去除残留，紫外照射30分钟。
二、试剂解冻与配制：精准混匀是关键
解冻规范：将冻存试剂盒置于2-8℃冰箱缓慢解冻过夜，避免反复冻融；
离心平衡：使用前瞬时离心（3000rpm,10秒），收集管壁液体；
预混MasterMix：按说明书比例将酶、dNTPs、缓冲液、荧光染料/探针混合，减少加样误差；
避光操作：SYBRGreen等染料对光敏感，全程使用避光管或铝箔包裹。
三、模板加入与上机
最后加模板：在专用生物安全柜中，将核酸模板最后加入反应体系，立即盖紧管盖；
设对照齐全：必须包含：
阴性对照（无模板对照NTC）→监控污染；
阳性对照→验证体系有效性；
内参基因（如GAPDH）→校正加样误差；
离心封板：96孔板需用光学膜密封，离心去除气泡，防止蒸发与荧光淬灭。
四、程序设置与结果判读
温度参数：严格遵循试剂盒推荐的变性（95℃）、退火（55-60℃）、延伸（72℃）时间与循环数（通常40-45cycles）；
荧光采集：SYBRGreen在延伸末期采集，TaqMan探针在退火/延伸阶段采集；
阈值设定：Ct值应在指数扩增期，阴性对照无扩增曲线，阳性对照Ct值符合预期。
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