本公司开发了简单快捷的支原体通用探针法荧光PCR试剂盒，既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

产品简介：

支原体属（Mycoplasma spp.）是支原体目、支原体科的 1 属，有近百个种。它们是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为 0.1～0.3 微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病。但是它们常常污染培养细胞，污染发生率高达到 50%左右，故培养细胞的支原体污染已经成为一个世界性的难题。由于当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的 DNA、RNA 及蛋白表达发生改变， 而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，故难以察觉，因此在早期快速诊断具有重要的意思。欧盟药典已经要求对使用培养细胞流程生产的生物工程制品进行 9 种支原体的核酸检测。为此本公司开发了涵盖欧盟所要求的 9 种支原体检测试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据支原体通用 DNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。

5.能检测出至少 30 种最常见的支原体，其中包括欧盟所要求的 9 种，它们是莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）、发酵支原体（M.fermentans）、猪鼻支原体（M. hyorhinis）、口腔支原体（M. oral）、精氨-酸支原体（M. arginini）、肺炎支原体（M. pneumonia）、鸡毒支原体（M. gallisepticum）、滑液支原体

（M. synoviae）和螺原体（Spiroplasma citri）。

6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

7.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

8.支原体通用探针法荧光PCR试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、荧光 PCR 专用模板稀释液、超纯水、支原体通用 qPCR 引物-探针干粉、支原体通用 qPCR 阳性对照(1E7 拷贝/μL)、使用手册。

自备试剂

样品 DNA，超纯水，核酸纯化试剂盒。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 24 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本   试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样  品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），

一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA-提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分样品管

N+2 个PCR 阴性

对照标准曲线样品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

支原体通用 qPCR

引物-探针混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 个待测 DNA 样本各 7 μL不加不加

超纯水不加7 μL不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液

（1-6 号）

不加

不加各 7μL（2 号样到 2 号管，3 号

样到 3 号管…）

四、数据处理

12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct 或 Ct 大于或等于 40，则为阴性。如果 Ct 小于 40 则为阳性。

选择我们的支原体通用探针法荧光PCR试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！