酶联免疫分析试剂盒用于定量或定性检测血清、血浆、尿液、细胞培养上清等样本中的抗原、抗体、激素、细胞因子等生物分子。其原理基于抗原-抗体特异性结合与酶促显色反应，实现对目标物的精准检测。然而，实验结果易受操作细节、环境条件与试剂保存状态影响。掌握
酶联免疫分析试剂盒的科学使用方法，是确保输出真实、可靠数据的关键。
一、使用前准备
试剂检查与平衡：
检查试剂盒是否在有效期内，包装是否完好；
将试剂（尤其是酶标抗体、显色液、终止液）从2-8℃冰箱取出，室温（18-25℃）平衡30-60分钟，避免冷凝水影响反应；
轻柔混匀液体试剂，避免剧烈震荡产生气泡。
样本处理：
血清/血浆样本需离心去除杂质，避免溶血、脂血或细菌污染；
根据说明书要求进行稀释，确保样本浓度在检测范围内。
仪器与耗材准备：
准备酶标仪（检测波长依显色系统而定，如TMB为450nm）、洗板机或手动洗瓶、移液器（定期校准）、一次性枪头与酶标板（若未预包被）。
二、加样与孵育
加样操作：
使用多通道移液器，确保加样量准确（通常50-100μL）；
避免交叉污染，更换枪头，加样针勿触碰孔壁；
设立空白孔、标准品孔（梯度稀释）、质控孔与待测样本孔。
孵育条件：
严格按照说明书控制孵育时间与温度（通常37℃水浴或恒温箱）；
覆盖封板膜，防止蒸发与污染；
孵育期间避免频繁开闭温箱。
三、洗涤步骤
充分洗涤：
每步反应后需洗涤3-5次，去除未结合物质，降低背景噪音；
使用洗板机时，确保洗液充满孔底，避免“花板”；
手工洗涤时拍干，但避免孔内干涸。
洗涤液配制：
使用蒸馏水或去离子水配制PBST（含吐温-20的磷酸盐缓冲液），现配现用。
四、显色与终止
显色反应：
加入显色液（如TMB或OPD），避光孵育指定时间（通常10-30分钟）；
观察颜色变化，避免过度显色导致信号饱和。
终止反应：
准确加入终止液（如2MH2SO2），立即终止酶促反应，稳定显色；
终止后轻轻震荡混匀，确保颜色均匀。
五、读数与数据分析
酶标仪检测：
在规定时间内（通常30分钟内）读取吸光度（OD值）；
设置正确的波长（主波长450nm，参考波长630nm）。
标准曲线绘制：
以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；
采用四参数拟合或线性回归计算待测样本浓度。
结果判读：
检查空白孔OD值是否达标（通常<0.1）；
质控品结果应在允许范围内，否则实验无效。
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