实时荧光PCR试剂盒通过特异性引物与荧光标记探针，在PCR扩增过程中实时监测目标DNA/RNA的累积量，实现高灵敏度、高特异性的定量或定性检测。其荧光检测的精准与否，直接决定检测结果的可靠性。任何操作偏差都可能导致假阴性、假阳性或定量失准。掌握
实时荧光PCR试剂盒的规范流程，是确保实验成功的关键。
一、实验前准备
环境分区：严格遵循“三区隔离”原则——试剂准备区、样本处理区、扩增区，避免交叉污染。各区专用移液器、耗材、工作服。
试剂解冻与混匀：试剂盒于-20℃避光保存。使用前置于冰上或4℃冰箱缓慢解冻，严禁室温长时间放置。解冻后轻柔涡旋或颠倒混匀，避免产生气泡，短暂离心收集液滴。
计算反应体系：根据检测样本数、阴性/阳性对照数量，精确计算所需预混液（MasterMix）、引物探针、酶等总体积，预留10%-15%余量。
二、反应体系配制
配置MasterMix：在试剂准备区，按说明书比例将缓冲液、dNTPs、引物、探针、DNA聚合酶（含UNG酶防污染）等混合，充分混匀并短暂离心。
分装至PCR管/板：使用带滤芯的无核酸酶枪头，将MasterMix等量分装至各反应孔。操作在冰上进行，防止酶活性提前启动。
加入模板：在样本处理区，将提取好的DNA/RNA模板（如病毒核酸、cDNA）加入对应反应管。每份样本使用新枪头，避免交叉污染。盖紧管盖，防止扩增时蒸发。
三、上机扩增
设置程序：根据试剂盒说明书设定PCR仪循环参数，通常包括：
UNG处理（若含）：50℃2-10分钟，降解潜在污染；
预变性：95℃3-10分钟，激活热启动酶；
扩增循环（40-45cycles）：95℃变性15秒→60℃退火/延伸30-60秒（采集荧光信号）。
选择荧光通道：正确匹配探针荧光染料（如FAM、VIC、HEX）与仪器检测通道。
运行程序：将PCR板放入仪器，确保位置准确，开始扩增。
四、结果判读
查看扩增曲线：理想曲线呈典型“S”形，基线平稳，指数期明显。无扩增或曲线异常需复检。
确定Ct值：软件自动设定阈值线，读取每个样本的循环阈值（Ct）。Ct值越小，起始模板量越高。
阴阳性判断：
阳性对照：必须有扩增且Ct值在预期范围；
阴性对照：无扩增或Ct值为“undetermined”；
待测样本：Ct值≤设定截断值（如40）判为阳性，否则为阴性。
定量分析：若为标准品梯度，绘制标准曲线，计算样本浓度。
021-62457717
当前位置：
电子邮箱：
公司地址：上海市奉贤区金海公路3265号14幢11545室