本公司开发了简单快捷的牛朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒，本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 qPCR 反应。

产品简介：

牛朊病毒蛋白（Bos taurus Prion Protein）是牛朊病毒疾病的致病因子，它由阮病毒基因（Prion Protein Gene，PRNP）编码，在朊病毒疾病的致病机   制中起到至关重要的作用。己有的研究证实包括人在内的动物对朊病毒疾病的易感性与PRNP基因的多态性相关。牛朊病毒蛋白影响朊病毒的致病性及传播，因此快速检测牛朊病毒蛋白具有重要意义。本产品是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测牛朊病毒蛋白 mRNA 的试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据牛朊病毒蛋白 mRNA 高度保守区设计，不会跟其他病原菌的 RNA 发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

6.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7.牛朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

探针法 qRT-PCR 缓冲液、探针法 qRT-PCR酶混合液 v2、荧光 PCR 专用模板稀释液、牛朊病毒蛋白 mRNA 探针法引物-探针干粉、牛朊病毒蛋白 mRNA阳性对照(1×10E7 拷贝/μL)、使用手册。

自备试剂

样品 RNA。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，

本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性

对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积  一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA- 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设  置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加）：

成分样品管

N+2 个RT-PCR 阴

性对照管标曲样品管

（1-6 管）

探针法 qRT-PCR 缓冲液各 10 μL10 μL各 10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液各 2 μL2 μL2 μL

牛朊病毒蛋白 mRNA RT-PCR

引物-探针混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

待测样品 RNA 模板各 5 μL不加不加

超纯水不加5 μL不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液

（1-6 号）

不加

不加各 5μL（2 号样到 2 号管，

3 号样到 3 号

管…）

四、数据处理

12.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，  不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。

13.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。

14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无

Ct 或 Ct 大于或等于 35，则为阴性。如果 Ct 小于 35 则为阳性。

选择我们的牛朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！