本公司开发了简单快捷的人朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒，引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。

产品简介：

朊病毒（Prion）又称朊粒、蛋白质侵染因子、毒朊或感染性蛋白质，是一类能侵染动物并在宿主细胞内无免疫性疏水蛋白质。朊病毒有两种构象:细胞型（正常型PrPc）和瘙痒型（致病型 PrPSc）。两者的主要区别在于空间构象上的差异，PrPc 是正常细胞的一种糖蛋白，仅存在α螺旋，而PrPSc 有多个β折叠存在，溶解度低， 且对蛋白酶表现抗性。由此可见朊病毒是空间构型改变了的正常蛋白质，是正常蛋白质变性所致。朊病毒对人类最大的威胁是可以导致人类和家畜患中枢神经系统退化性病变，最终不治而亡。因此检测 PrP mRNA 具有重要的意义。为此本公司以探针法 qPCR 技术为基础开发了PrP mRNA 的检测试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据人 PrP mRNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 RNA

发生交叉反应。

5.既用于定性检测，又用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

6.本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 qRT-PCR 反应。

7.人朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

探针法 qRT-PCR 缓冲液、探针法 qRT-PCR酶混合液 v2、荧光 PCR 专用模板稀释液、人朊病毒蛋白mRNA 探针法引物-探针干粉、人朊病毒蛋白mRNA 阳性对照(1×10E7 拷贝/μL)、使用手册。

自备试剂

样品 RNA。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。如果需要RNA 阳性样品，需要另外订购。

1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对

照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA -提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qRT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照

（用水做模板），1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置

完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分样品管

N+2 个RT-PCR

阴性对照标准曲线样品管

（1-6 管）

探针法 qRT-PCR 缓冲液各 10 μL10 μL各 10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1μL1 μL各 1 μL

人 PrP mRNA qRT-PCR

引物-探针混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 个待测 RNA 样本各 6 μL不加不加

超纯水不加6 μL不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液

（1-6 号）

不加

不加各 6 μL（2 号样到 2 号管，3

号样到 3 号

管…）

注：部分（如：伯乐 CFX96）机型如果两步法效果不理想可采用三步法：50℃ 10

分钟， 95℃ 10 分钟，（94℃ 15 秒、65℃ 15 秒、72℃ 30 秒）循环 35-45

次，每个循环第三步采集荧光信号。四、数据处理

12.如果样本制备阳性对照或PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实

验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染， 则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。

13.如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。

14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须没有读数， 或者大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40。对待测样品，如果其 Ct 没有读数、大于或等于 40 则均为阴性，如果小于 40 则为阳性。

选择我们的人朊病毒蛋白mRNA探针法荧光PCR试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！