大量包涵体纯化试剂盒大量提取，1 次可处理多达 5 升的菌液，相当于 50 次中量提取。

产品简介：

本产品是包涵体微量纯化试剂盒的大提升级产品，用于大量，快速的提取高质量的包涵体。

产品特点：

1.大量提取，1 次可处理多达 5 升的菌液，相当于 50 次中量提取。

2.适合制备级别的包涵体纯化，需在 50 mL 以上的离心管或离心瓶中完成。

3.能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到 60%以上。

4.本产品主要用于从大肠杆菌宿主中纯化包涵体，也能用于真菌和其他表达系统，  但纯化条件（主要是细胞裂解条件需要自行优化）。

5.对大肠杆菌宿主，本手册提供高压裂解和酶学裂解两种破碎细菌，超声打断DNA 的实验方案。

6.得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。

7.本产品足够 2 次纯化，每次可以处理 5 升菌液。

8.大量包涵体纯化试剂盒只可用于科研。

产品参数：

产品规格

保存和运输

常温运输和保存（溶菌-酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存），有效期一年。

自备试剂

如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶抑制剂混合物。

使用方法：

一、细胞沉淀

1.转移 1-5 升的菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。

2.5,000 g（相当于 Sorvall GSA 转头 5500 rpm）4℃离心 15-30 分钟，小心弃上清。

3.复称重量，差值就是细菌的湿重。1 升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为 3 克， 所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。

4.细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二、高压破碎法（French Press）+超声法裂解细菌（推荐方法）

1.按每克细菌湿重加入 3 mL 包涵体纯化溶液 A 重悬细胞，1-5L 的菌液得到的细菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵体纯化溶液 A。加入后可以用玻璃棒搅拌或用 Waring 捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过 10 克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。

2.留少量样品做未裂解对照，剩余得样品通过压力为 16000-18000 lb/in2 的高压细胞破碎仪裂解，收集的细胞裂解液需放冰上，显微镜下检查裂解前和裂解  后完整细菌得数量，反推出裂解细菌的比例。

3.重复上步操作一次或多次，直到在显微镜下观察不到或只能观察到非常少的完  整细菌。

4.一般经过多次高压细胞破碎的裂解液不会非常粘稠（DNA 被打断）。如果还是非常粘稠，将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理打断DNA，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒），直到不再粘稠为止。此进行此操作时，最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会  使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

三、酶法+超声法（在没有高压破碎仪器时的候选方法）

5.按每克细菌湿重加入 3 mL 包涵体纯化溶液 A 重悬细胞，1-5L 的菌液得到的细菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵体纯化溶液 A。加入后可以用玻璃棒搅拌或用 Waring 捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过 10 克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。

6.在细菌悬浮液中加入溶菌-酶干粉，使其终浓度为120mg/mL（45mL 加5.4g），搅拌混匀后 37℃放置 30 分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的 DNA 将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

7.将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理打断 DNA，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒），一般需要 5 分钟。具体可以根据溶液粘稠度决定。此进行此操作时，最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

四、包涵体纯化

8.将超声处理后的细胞裂解液转移到离心瓶中，7000g 4℃下高速离心 60 分钟

（注意：转子不同 7000g 对应的离心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为 SDS-PAGE 对照样品。

9.将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在预冷的包涵体纯化溶液 B 中。每克细菌需要 5 mL 包涵体纯化溶液溶液 B，1 升细菌的湿重约 3 克，大约需要 15 mL， 用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置 5 分钟。

10.7000g 4℃下高速离心 30 分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻-底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理  过程中使用过溶菌-酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体第一次洗  涤的对照样品。

11.重复第 9-10 步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤 2 次（共 3 次洗涤），小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的包涵体纯化溶液 B 足够一次 5 升规模的提取洗 3 次，如需更多包涵体纯化溶液 B 请单独购买。

12.上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占 60%重量，其余 40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。

13.估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水平，如果表  达水平为 1%，则 1 克湿重的细菌中将含有 1 mg 重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在 75%，即 1mg 重组蛋白质能得到 0.75 mg，丢失0.25mg。

五、包涵体的溶解

14.在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。  如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入 1 mL 包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为 4-5 mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入 3 mL 包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为 1-2 mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须 45-65℃溶化并混匀后才能使用。注意：包涵体溶解液含6M 盐酸胍，溶解蛋白能力强于含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 时不能直接上样。客户可用自备的尿素配制 8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不稳定， 所以不能长期放置）溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。

15.室温放置 1 小时使蛋白质充分溶解。

16.7000g 4℃离心 60 分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。含溶解蛋白的上清脱盐后，可以进行 SDS-PAGE 电泳，检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完-全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

17.将上清（溶解的包涵体）分成 10-20mL 一份，放于塑料离心管中（不要超过离心管容量的 70%）置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的优良复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶

菌-酶，在 SDS-PAGE 分析时可能有额外条带出现。

选择我们的大量包涵体纯化试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！