产品简介：
用 PCR 对 DNA 进行生物-素标记的原理是用带生物-素标记的 dNTP 进行PCR 扩增，这些 dNTP 掺入到PCR 产物中之后，扩增得到的 DNA 片段自然就带有生物-素标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理开发的。
产品特点：
1.一站式，本试剂盒经过精心优化，不需要用户自己摸索标记条件。
2.优化的生物-素掺入率，能有效降低探针中生物-素分子之间的可能空间阻碍，检测效果佳。
3.得到的生物-素标记DNA 探针可以用于 Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。
4.既可用于制备双链DNA 探针，也可以用于制备单链 DNA 探针。
5.一次标记反应可以得到μg 级的生物-素标记双链 DNA 探针或约 700 ng
生物-素标记单链DNA 探针，足够多次杂交实验用。
6.本产品足够 5 次生物-素标记 PCR 反应(50 μL 体系)。
7.DNA 探针生物-素标记试剂盒(PCR 法)只能用于科研。
产品参数：
产品规格
成份规格包装
标记专用PCR Mix(含酶)30 μL0.5 mL 红盖管
dNTP Mix，2.5 mM each25 μL0.5 mL 白盖管
含 Biotin-11-dUTP 的
dNTP，2.5 mM each25 μL0.5 mL 绿盖管
超纯水1 mL1.5 mL 蓝盖管
使用手册1 份无
保存和运输
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂
无
使用方法：
DNA 模板和模板专一性引物，常规 PCR 反应所需试剂，琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒。
一：准备工作
1.按常规的方法设计PCR 引物，使 PCR 产物(探针)长度在 400-800 bp
之间。过短则生物-素标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2.为保证成功率，最好先用常规 PCR 产物制备 DNA 片段，再以之为模板进行标记PCR 反应。不推荐以基因组 DNA 或其他背景复杂的 DNA 为模板直接进行 PCR 标记反应。
二：用常规PCR 制备模板
3.用自备的 PCR 试剂盒按下表配置 50 μL 的常规 PCR 反应以制备标记
PCR 模板：
成份加入量
自备的 2×PCR Mix(含酶，含 dNTP)25 μL引物一和引物二(10 pmol/μL)各 5 μL
1 μg 基因组 DNA 或 1 ng 质粒 DNA1 μL
超纯水补到 50 μL
4.按引物 Tm 值设计的PCR 参数进行常规PCR。
5.用自备胶回收试剂盒回收常规PCR 产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物，避免这些引物干扰后续的标记 PCR 反应。
三：标记 PCR 反应
注意：由于双链PCR 探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记 PCR。在设置标记 PCR 时必须做一个
常规PCR 对照(本试剂盒足够 5 次标记 PCR 实验)。
成份标记PCR常规PCR(自备)
标记专用PCR Mix(含酶)6 μL6 μL
含 Biotin-11-dUTP 的
dNTP，2.5 mM each5 μL不加
dNTP Mix，2.5 mM each不加5 μL
若双链标记，加引物一和引物二；
若单链标记，只加一条引物
各 50 pmol
各 50 pmol
胶回收所得 PCR 产物10 ng(对双链标记)
100 ng(对单链标记)10 ng(对双链标记)
100 ng(对单链标记)
超纯水补到 50 μL补到 50 μL
6.由于此步所用的 PCR 引物和第 3 步的 PCR 引物完-全一样，故可以参考第 3 步PCR 参数进行标记 PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到 35-55 个循环，使扩增得到的探针 DNA 片段参差不齐，杂交时这种DNA 能形成网络结构，杂交效果比长度整齐的 DNA 更好；二是延伸步骤的时间增加 15 秒，因为标记 dUTP 掺入到DNA 的速度比常规的 dTTP 慢，增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记 dUTP 掺入到合成的DNA 探针中；三是降低复性温度 5-7℃，因为标记核苷酸掺入到 DNA 后，含标记核苷酸的 DNA 的 Tm 值将比正常的DNA 低。
7.PCR 结束后，取标记 PCR 反应液和对照反应液 3-5 μL 进行琼脂糖凝胶
电泳(一定要使用浓度已知的 DNA marker)，检测标记是否成功。由
于标记 DNA 含有额外的标记物、分子量更大，其泳动速度将慢于常规PCR 产物。下图是一个典型的双链标记 PCR 产物和常规 PCR 产物电泳速度差异的比较图：
标记的 DNA(右)与未标记的 DNA(左)电泳比较
8.探针的定量：电泳所用的DNA marker 浓度已知(如果不确定，可以问供应商)，上样体积已知，故上样量已知，就可通过双链探针 DNA 和DNA marker 对应条带的相对亮度来估计探针 DNA 浓度。例如，如果探针长度为 500 bp，而 marker 中 500 bp 这条带的浓度是 10 ng/μL，共上样 10 μL，则 500 bp 这条带的上样量为 100 ng。标记的探针 DNA在紫外下亮度只有它的一半，则探针 DNA 的上样量为 100/2=50 ng， 如果上样量是 5 μL，则探针的浓度是 50/5=10 ng/μL。但是，如果制备的是单链 DNA 探针，则不能按此法估计浓度，因为单链 DNA 结合核酸染料(如 EB 和 SYBR GreenI)的能力远低于双链 DNA。但可采用银染法定量(跟marker 比较)。一般 100 ng 模板经单链标记 PCR 扩增可得到 700 ng 左右的单链探针。
9.单链 PCR 标记产物可不经纯化直接加到杂交液中，双链 PCR 标记产物需加热到 95-100℃ 5 分钟变性然后放冰上急冷后再加到杂交液中使用。
10.如果探针不立即使用，需要放-20℃长期保存，不能放常温保存，否则 Taq DNA 酶的残留的外切酶活性会降解探针 DNA。如果需要纯化探针 DNA，请使用本公司的核酸探针纯化试剂盒(排阻层析法)。
选择我们的DNA 探针生物-素标记试剂盒（PCR 法），就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！
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