PCR法DNA探针标记试剂盒（不含标记底物）足够 10 次 50 µL 体系的常规 PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和 5 次 50 µL 体系的标记反应。

产品简介：

PCR 标记的原理是用带标记的 dNTP 进行 PCR，最后得到的 PCR 产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理的基础上开发。

产品特点：

1.一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。

2.一次标记可以得到µg 级的双链 DNA 探针或约 700ng 的单链 DNA 探针， 足够多次杂交实验用。

3.既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。

4.A 型需自备含标记核苷酸的 dNTP，B 和 C 型分别含生物-素和地高-辛标记的底 物 。 可 用 的 自 备 标 记 底 物 包 括  fluorescein-dUTP 、 hydroxycoµmarin-dUTP、resorµfin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

5.掺入率一般为 4-5%，有效降低了空间阻碍，检测效果-最-佳。

6.标记探针可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。

7.足够 10 次 50 µL 体系的常规 PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和 5 次 50 µL 体系的标记反应。

8.PCR法DNA探针标记试剂盒（不含标记底物）只能用于科研。

产品参数：

名称规格包装

标记专用 PCR Mix(含酶)500 µL0.5 mL 红盖管

dATP，10 mM each50 µL0.5 mL 白盖管

dTTP，10 mM each50 µL0.5 mL 绿盖管

dGTP，10 mM each50 µL0.5 mL 黄盖管

dCTP，10 mM each50 µL0.5 mL 本色盖管

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA 模板和模板专一性引物，常规 PCR Mix。

使用方法：

一：准备工作

1. 按常规的方法设计 PCR 引物，使 PCR 产物（探针）长度在 400-800bp 之间。过短则地高-辛标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。

2.为保证成功率，最好先用常规 PCR 产物制备 DNA 片段，再以之为模板进行标记 PCR 反应。不推荐以基因组 DNA 或其他背景复杂的 DNA 为模直接进行 PCR 标记反应。

3.四种 10mM 的 dNTP 是分开提供，用于制备 50µL 非标记 dNTP（2mM each，用于非标记PCR，用于制备标记PCR 的模板。配制方法是四种10mM的dNTP 各加 10µL，再加水 10µL 即可）和 25µL 标记dNTP（2mM each，其中标记核苷酸和对应的非标记核苷酸的比例需要自行优化，假如是 biotin或 DIG 标记的是 dUTP，则其对应的非标记核苷酸是 dTTP，两者的最佳比例一般为 1：3；如果是 BrdUTP，则两者的最佳比例为 1：1。配制方法是三种 10mM 的 dNTP 各加 5µL，再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为 2mM，再补水到 25µL 即可）。

二：非标记 PCR 产物的制备

1.设置 50µL 非标记 PCR：2×标记专用 PCR Mix 25 µL，dNTP Mix（2mM each）5µL，自备的探针引物（10pmol/µL）各 1µL，1 µg 基因组 DNA或 1ng 质粒 DNA，补超纯水到 50µL。

2.按已经优化的 PCR 参数进行常规 PCR。

3.胶回 PCR 产物并定量，胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记 PCR。

三：标记 PCR 反应

注意：由于双链 PCR 探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效

率，因此强烈推荐使用单链标记 PCR。

成份样品非标记对照

2×标记专用 PCR Mix25 µL25 µL

含标记核苷酸的 dNTP Mix（自备）5 µL不加

dNTP Mix，2mM不加5 µL

若单链标记：加探针引物其一50 pmol50 pmol

若双链标记：加探针引物一和引物二各 50 pmol各 50 pmol

胶纯化所得 PCR 产物（单链标记可用

100ng 模板）10 ng10 ng

超纯水补到 50 µL补到 50 µL

1. 按第 5 步的 PCR 参数进行标记 PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到 35-55 个循环。由于模板为纯化后的 PCR 产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加 15 秒，因为标记 dµTP 参入到 DNA 的速度比常规的 dTTP 慢；三是降低复性温度 5-7℃，因为标记核苷酸参入到 DNA 后，新模板的 Tm 值将降低。

2. 标记探针的定量：取标记反应液和对照反应液 1-5 µL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的 DNA Marker 一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记产物中额外带有生物-素，地高-辛等、其泳动速度将慢于非标记 PCR 产物（但同位

素标记不能用此法）。下图是一个典型的双链 PCR 产物电泳结果图：

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