通用免克隆质粒DNA制备试剂盒所得质粒 DNA 没有任何 RNA、宿主 DNA 或内毒素的污染。

产品简介：

分子克隆（Molecular Cloning）是分子生物学领域的奠基性技术，它是利用质粒作为载体来克隆所需的 DNA 片段，并利用大肠杆菌作为宿主进行扩增，使 DNA 片段取之不尽。分子克隆技术极大促进了生物学的发展，但是，其缺点是耗时并且步骤繁多，从连接到重组子鉴定一般需要 3-7 天（取决于宿主细胞）。为克服此缺点，本公司根据滚环扩增原理开发了本产品。

产品特点：

1.即开即用，十分方便，用户不需要辛苦摸索条件。

2.起始材料为 DNA 片段-载体连接产物或 DNA 片段自身环化产物，到扩增产物鉴定最快只需要 6 小时完成（扩增 4 小时+酶切鉴定 2 小时）。如果起始 DNA 少， 则需要更长的时间。

3.使用自备的 DNA 插入片段专一的引物，只扩增带有 DNA 插入片段的重组质粒， 不扩增自连载体。如果连接反应时已经排除了载体自身环化，则可以使用本试剂盒提供的 RCA 引物。

4.适用于任何长度的 DNA，也适用于对宿主有毒的 DNA 和在宿主细胞内不稳定的重复 DNA。

5.不需要感受态细胞。

6.所得质粒 DNA 没有任何 RNA、宿主 DNA 或内毒素的污染。

7.高保真，所得 DNA 跟分子克隆制备的 DNA 一样的保真率。

8.所得 DNA 可以直接用于酶切、一代和二代测序、转染和酵母转化。酶切和自身环化后还可以转化大肠杆菌。

9.含荧光染料，可以实时检测扩增的进行。

10.本产品足够 50 次 10uL 体系的免克隆质粒制备反应。

11.通用免克隆质粒DNA制备试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成份规格包装

dNTP-染料混合液75 uL0.5mL 蓝盖管

RCA 专用随机引物溶液100 uL0.5mL 白盖管

phi29 DNA 聚合酶，10U/uL25 uL0.5mL 红色管

10×Phi29 DNA 聚合酶缓冲液50 uL0.5mL 绿色管

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输，-20℃保存,有效期为一年。

自备试剂

插入片段专一性引物、超纯水。

使用方法：

1.用常规方法进行插入片段和克隆载体的连接。由于本产品基于滚环扩增，故只能  扩增没有切口的环状的 DNA。因此在连接时，需要注意两点：一是最好通过粘性末端不同或碱性磷酸酶处理载体，防止载体自连，这样就可以使用本试剂盒提供  的 RCA 专用随机引物，不必再合成插入片段专一的引物。二是样本中必须有一条没有任何切口，变性后还是环状单链的 DNA。常规的 AT 克隆，由于 PCR 片段的两个 5’端没有磷酸化，所以连接后重组质粒的四个切口其实只连接上了两个，另外两个并没有连接上。这种带切口的重组质粒并不影响转化，但不能进行RCA 扩增，因为 DNA 变性后两条 DNA 链其实还是线状 DNA。所以这种 PCR 片段需要先磷酸化，或者 PCR 的时候就用 5 端磷酸化的引物，这样连接后才能用于 RCA 扩增。

2.按下表设置 10uL 的环状 DNA RCA 反应：

成分管 1

（样本）管 2

（无模板对照）

连接产物，100pg1 uL-

RCA 专用随机引物溶液2 uL2 uL

自备 DNA 插入片段专一性引物（注）40pmol40pmol

dNTP-染料混合液1.5 uL1.5 uL

10×Phi29 DNA 聚合酶缓冲液1 uL1 uL

加超纯水到到水到 9.5 uL加水到 9.5 uL

在 PCR 仪器上 95℃ 3 分钟，放室温待温度下降到常温后加入

phi29 DNA 聚合酶，10U/uL0.5 uL0.5 uL

合计10 uL10 uL

注：自备引物的方向跟常规 PCR 的方向相反，长度只要 6-10 个碱基即可。使用时必须跟本试剂盒提供的 RCA 专用随机引物共同使用。

3.放荧光定量 PCR 仪器上，设置 30℃保温 16 小时，每 10 分钟设置成一个循环， 采集一次 SYBR 通道的荧光信号。由于是实时检测反应，所以反应不一定要 16 小时后终止，可以在扩增曲线进入平台期后（已经没有新的 DNA 合成）提前结束。如果没有荧光定量 PCR 仪器，则只能电泳检测或 PCR 检测是否有扩增。

4.典型实验结果。有扩增的样本将有平缓的 S 荧光曲线，无模板对照将没有此标准扩增曲线（见下图）或扩增曲线：

5.65℃保温 10 分钟灭活 phi29 DNA 聚合酶。由于 phi29 DNA 聚合酶有很强的 3-5 外切酶活性，因此必须灭活，否则它将逐渐降解已经合成的 DNA。

6.扩增所得质粒 DNA 为超分支结构，直接电泳就是模糊一片，并不能进行分析鉴定。因此必须先酶切再电泳。可以选择跟常规重组子鉴定一样的酶进行酶切电泳，  也可以用菌落 PCR 一样的方法进行菌落 PCR 来判断是否克隆成功。扩增产物也可以直接用于转染、酵母转化、一代或二代测序。如果转化大肠杆菌，则需要先用只酶切重组质粒一次的限制性内切酶酶切，再自连，再转化。也可以用超纯水将 1uL 扩增产物稀释 100 倍后再用 1uL 稀释液作为模板，再进行 RCA 扩增，得到更多的 DNA。

选择我们的通用免克隆质粒DNA制备试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！