DNA 5’末端磷酸化试剂盒使用本试剂盒之前，不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使 5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。

产品简介：

本产品为 DNA 5’末端标记系统，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’末端进行高效标记反应。

产品特点：

1.使用本试剂盒之前，不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使 5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。

2.合成的单链或双寡核苷酸的 5’末端游离的 OH 基团都能通过 Kinase 反应被标记

（或者只是简单的磷酸化）。

3.提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行， 均能得到大于106cpm/pmol（5’﹣end）的比活性。

4.快速，最快 25 分钟即可完成标记反应。

5.本产品足够 20 次 20L 体系的填入法标记实验。

6.DNA 5’末端磷酸化试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成份规格包装

T4 多聚核苷酸激酶

（10 U/μL）20 L0.5mL 绿盖管

5×交换反应缓冲液100 L0.5mL 红盖管

10×磷酸缓冲液50 L0.5mL 黄盖管

Control DNA20 L0.5mL 蓝盖管

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的标记、未标记的 ATPs、牛小肠碱性磷酸。

使用方法：

一、交换反应

1.实验前需自备的试剂：7M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等

2.在微量离心管中制备下列反应液：

注：5 pmoles 的 5’末端约等于 0.17μg 的长 100bp 的双链 DNA。

3.37℃反应 30 分钟。

4.70℃加热 5-10 分钟使酶失活。

5.加入 10μL 的 7M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做乙醇沉淀时使其终浓度达 300mM。

6.  加入 87.5μL（2.5 倍）的冷无水乙醇，-20℃放置 30-60 分钟。

7.离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。

8.用适当 Buffer 溶解沉淀。

注：通过第 5-8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完-全其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯-酚抽提除去蛋白质时， 请在第 8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记

A.去磷酸化反应

9.实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯仿、3M NaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等。

10.在微量离心管中制备下列反应液：

成分用量

自备的 DNA 片段133 μL(≤10 μg)

1 M Tris-HCl，pH 8.015 μL

牛小肠碱性磷酸酶

（CIAP，10~20 U/μL）2 L

灭菌的超纯水补水至 150 L

总体积150 μL

11.50℃反应 30 分钟。

12.加入 150 μL 的 TE 饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。

13.离心，取上层（水层）移到另一个微量离心管中。

14.重复操作 12-13。15.

16. 加入 7.5μL 的 3M NaCl（最终浓度 150mM）。

17. 加入 375μL（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置 30-60 分钟。

18.离心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。

19.使用 20μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。 B.磷酸化反应（前反应）

20.在微量离心管中制备下列反应液：

21.37℃反应 30 分钟。

22.下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。

三、合成 DNA 寡核苷酸的标记

23.在微量离心管中制备下列反应液：

24.37℃反应 30 分钟。

25.下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。

26.当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G﹣50 层析柱（需另购）对于去除未掺入的 dNTPs 效果很好，它还能大幅减少小于 20 个碱基的DNA 寡核苷酸和小于 20bp 的双链DNA 的量。使用之前需要在70℃加热5-10 分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于 10 个碱基的寡核苷酸。

选择我们的DNA 5’末端磷酸化试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！