随机引物冻干粉（10 碱基、无-修饰）是 10 碱基、无-修饰随机引物的干粉，用于逆转录反应和随机引物标记。

产品简介：

随机引物冻干粉（10 碱基、无-修饰）是 10 碱基、无-修饰随机引物的干粉，用于逆转录反应和随机引物标记。本产品只能用于科研，不能用于临床。

产品参数：

规格及成分

保存和运输

常温运输，低温保存，有效期一年。

自备试剂

超纯水。

使用方法：

一、逆转录反应

1.在随机引物 (10 碱基，无-修饰) 干粉管中加入 25 uL 自备的超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到 0.2 ug/uL 的 10 碱基随机引物溶液（ -20℃保存，下同）。

2.在一干净的反应管中加入自备的 RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因组DNA 污染。

RNA 模板种类加入量

总 RNA100-500 ng

或 poly(A) mRNA10-500 ng

或专一的 RNA0.01 pg-500 ng

3.加入引物和水

4.加水到 13 uL。

5.70℃保温 5 分钟后立即冰浴，此步可以打开 RNA 的二级结构。

6.再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。

7.37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保温 5 分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成 25℃ 5 分钟以便其跟RNA 结合。

8.加入 1 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。

9.42℃保温 60 分钟。但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，待合成了一段 cDNA 后，然后再转移到 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

10.70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为PCR 模板使用，不需要纯化。

二、随机引物标记

11.需要在随机引物 (10 碱基，无-修饰) 干粉管中加入 12.5 L 自备超纯水，涡旋震荡 30 秒，短暂离心 10 秒。得到 0.4 ug/uL 的 10 碱基随机引物溶液，放冰上待用。

12.在一干净的塑料离心管中加入下列成分：

成分用量

模板 DNA

（PCR 回收片段，长度 100-1000 bp）50-150 ng

5×随机引物地高-辛标记反应液4 uL

0.4 g/uL 的 10 碱基随机引物溶液4 uL

超纯水补水到 19 uL

13.PCR 仪上 100℃加热 10 分钟使模板 DNA 彻-底变性。

14.立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA 单链又会杂交形成双链。

15.离心数秒使所有液体集中在管底。

16.加入 1 uL Klenow exo DNA 聚合酶，轻柔吹打混匀。此时反应总体积为 20uL。

17.37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模板 DNA 和保温时间相关，模板越多，新合成探针多，但新合成探针/模板比例低，杂交信号低。模板越少，新合成探针少，但探针/模板比例高，杂交信号高。但探针少到一定程度，也不会有杂交反应发生。因此用户需要探针合成量和杂交信号强弱在这两者之间进行折衷选择。

18.反应结束后加热 100℃ 5 分钟使 DNA 聚合酶变性，同时使 DNA 探针变性成单链。变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接将变性后的探针加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。

随机引物冻干粉（6 碱基、无-修饰）

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