细菌细胞膜蛋白纯化试剂盒可用于 Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Klebsiella aerogens，Pseudomonas aeruginosa，Caulobacter crescentus 等细菌。

产品简介：

细菌细胞膜蛋白纯化试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后，通过超速离心分离出细菌细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去污剂法相比。

产品参数：

规格及成分

保存和运输

常温运输和保存，但 DNase I 干粉需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

膜蛋白溶解液(取决于后续实验。如果后续实验为 SDS-PAGE，则用 1× SDS-PAGE 上样液作为溶解液；如果用于 2D 电泳，则使用 1×等电点电泳上

样液作为溶解液)。

使用方法：

准备：第一次使用本试盒时要将所有 DNase I 干粉倒入 B 中，轻柔颠倒使 DNase I 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则 DNase 将逐渐失去活性。此外，最好在实验前 1 小时将细菌膜蛋白纯化细菌细胞膜蛋白纯化溶液 C 冰浴预冷。

用法一：小量制（用于上样量比较小的 SDS-PAGE 等实验）

1.     收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500g 室温离心 10 分钟后弃上清。

2.加入 2 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A 中。

3.2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

4.加入 0.5 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 20-40 mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。

5.用超声或 French Press 方法裂解细胞，直到 80%以上的细菌都裂解为止。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。

6.2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料离心管中（如 BeckmanOptima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。

7.在上清(细菌裂解液)中加入 5 mL 预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液 C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置 30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。

8.用 BechmanOptima 台式超速离心机在 115，000 g， 4℃下离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。

9.小心移弃上清，在沉淀中加入 0.2 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液A，充分吹打混匀。

10.用 BeckmanOptima 台式超速离心机在 115，000 g， 4℃下离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。

11.小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如 1×SDS-PAGE 上样液中，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度将在 1 mg/mL 左右。

用法二：大量制备（要用于上样量比较的 2D 电等实验）

12.收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420 在 1.5 左右即可)，2500g 室温离心 10 分钟后弃上清。

13.加入 20 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于细菌细胞膜蛋白纯化溶液A 中。

14.2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。

15.加入 5 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 200-400 mL，细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在细菌细胞膜蛋白纯化溶液A 中的细菌可以放-80℃长期保存。

16.用超声或 French Press 方法裂解细胞，直到 80%以上的细菌都裂解为止。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程。

17.2500 g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀(未破裂细胞)。

18.在上清（细菌裂解液）中加入 50 mL 预冷的细菌细胞膜蛋白纯化溶液 C， 轻轻在冰浴中搅拌混匀 30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以最-低速度搅拌。

19.用 Beckman Type 55.2 Ti 转头在 115，000 g， 4℃下离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

20.小心移弃上清，在沉淀中加入 2 mL 细菌细胞膜蛋白纯化溶液 A，充分吹打混匀。

21.用 Beckman Type 55.2 Ti 转头在 115，000 g， 4℃下离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。

22.小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液(如 1×等电点电泳上样液，可从本公司购买)，所得膜蛋白的浓度在 1 mg/mL 左右。

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