乙酸-尿素-PAGE 电泳试剂盒足够 30 次 0.1 cm×14 cm×14 cm 大小的 AU-PAGE。

产品简介：

本产品专门用于乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Acetic Acid-Urea- PAGE，AU-PAGE，乙酸-尿素-PAGE）。

产品特点：

1.一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。

2.采用不连续胶系统，分辨率高，能有效分离只有一个修饰基团不同的组蛋白。

3.使用光激发剂，故不需要进行长时间的预电泳。

4.适用于分离等电点偏碱性的各种碱性蛋白，如嗜中性防御素、酪-氨酸酶 、鱼精-蛋白、组蛋白以及这些碱性蛋白的各种修饰形式（如乙酰化、泛素化等）。

5.电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交等实验。

6.本产品足够 30 次 0.1 cm×14 cm×14 cm 大小的 AU-PAGE。

7.乙酸-尿素-PAGE 电泳试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

30次

保存和运输

常温运输和保存，但塑料袋包装的成分需要低温运输，-20℃保存。有效期一年。

自备试剂

去离子水、透析袋（去除样本中的盐离子用）。

使用方法：

一：试剂和样本准备工作 

1.60%丙烯酰胺母液：加 160 mL 自备去离子水到装有丙烯酰胺干粉的 250 mL 棕色瓶中，终于体积为 250 mL。充分摇晃溶解（不能加热）。一次没用完的本溶液可以放 4℃长期保存。

2.2.5%甲叉双丙烯酰胺母液：加 100 mL 自备去离子水到装有甲叉双丙烯酰胺干粉的 120 mL 本色瓶中，摇晃溶解（不能加热）。没用完的需 4℃保存。

3.8 M 尿素母液：用本试剂盒提供的尿素干粉和自备的去离子水配制 8 M 的尿素母液。如果配制 10 mL，则将 4.8 g 尿素溶于少量水中，最后定容到 10 mL。没用完的本溶液需放-20℃保存，避免产生氰酸根离子。

4.待电泳的蛋白样本必须没有离子，故最好先用 3500 Da 截留的透析袋在2.5%乙酸溶液中充分透析，然后分装成 5-50 μg/管，冷冻抽干。也可以用三氯-乙酸沉淀，丙酮洗涤去盐离子。本试剂盒不提供相关试剂。

二：PAGE 胶的配制（整个过程在常温操作，不能在低温操作）

5.下表是配制 0.1 cm×14 cm×14 cm 大小 PAGE 胶所需各成分的用量。由于常见的碱性蛋白组蛋白和鱼精-蛋白分子量都比较小，因此需用 4%的浓缩胶浓度和 15%的分离胶浓度。若胶大小变化或者碱性蛋白分子量较大，所配制的胶的体积和浓度需要相应调整。在两个容器中分别加入下列成分:

6.灌分离胶：按上表配制分离胶，将溶液摇晃混匀，然后用真空泵接上管子抽真空 15 分钟去除溶液中的氧气，然后加入 125 L 氨水、175 L TEMED 和

2.38 mL 光激发剂，迅速摇匀并灌胶，在分离胶的液面距离胶板顶部 5 cm 的时候，停止灌胶。加入 1 mL 去离子水。由于分离胶比重较大，水将覆盖分离胶并使得胶面平整。将胶板放在强光下（如看 X 光片的灯箱前）促进光激发剂活动。室温聚合 30-60 分钟。凝固后倒出水，插入梳子。

7.灌浓缩胶：按上表配制分离胶，将溶液摇晃混匀，然后用真空泵接上管子抽真空 15 分钟去除溶液中的氧气，加入 35 L 氨水、50 L TEMED 和 650 L 光激发剂，迅速摇匀并灌胶。将胶板放在明亮处，促进光激发剂活动。室温聚合 30-60 分钟。浓缩胶的高度有 1 cm-2 cm 即可。

三：电泳（整个过程在常温操作，不能在低温操作）

8.在等待胶凝固的过程中，配制上样液：在 1.5 mL 塑料离心管中，加入 7.7 mg 上样液成分 1，0.9 mL 8 M 尿素母液，50 μL pH 指示剂，50 μL 氨水。混匀后即得上样液。上样液只能现配现用，没有用完的不需要保留。

9.浓缩胶凝固后，拔出梳子，取出胶下面的隔条，将胶板上架到电泳槽上。先在下槽加入 1×AU-PAGE 电泳缓冲液。上槽的电泳缓冲液待上样后再加。

（注：1×AU-PAGE 电泳缓冲液由本试剂盒提供的 10×AU-PAGE 电泳缓冲液稀释而来，在 1 倍体积的 10×AU-PAGE 电泳缓冲液中加入 9 倍体积的去离子水，混匀后即可。1×AU-PAGE 电泳缓冲液可以重复使用 3 次）

10.在第 4 步制备的冷冻干燥的蛋白样本中每管加入上步制备的上样液 40 μL，室温溶解 5 分钟。为避免尿素修饰蛋白，溶解时间不要超过 5 分钟。如果加入样本后，溶液不是粉红色，则表示蛋白样本中有残留乙酸使得 pH 过低，蛋白溶解不充分，需要补加氨水调到颜色变成粉红色，恢复碱性。

11.上样前每管补加 2.5 μL 乙酸进行酸化，再加 2 μL AU-PAGE 电泳示踪剂，补水到总体积为 50 μL（补水多少取决于第 10 步加入了多少氨水调 pH）。

12.将 50 μL（含 5-50 μg 总蛋白质）全部上样，多余的加样孔中要加入空白样本（40 μL 上样液+2.5 μL 乙酸+2 μL AU-PAGE 电泳示踪剂+5.5 μL 去离子水）以平衡电泳时各加样孔的盐离子浓度。

13.小心在上槽加满新鲜配制的 AU-PAGE 电泳液。加入了 AU-PAGE 电泳液后的凝胶必须立即使用，不得放置。

14.接上电源线。注意 AU-PAGE 的电泳方法跟 SDS-PAGE 相反，故正极需要接到上槽，负极需要接到下槽。碱性蛋白在电泳体系中带正电，向负极移动。

15.固定电压到 300 V 电泳，如果是小的胶，可以固定电压到 250 V 电泳。在电泳过程中电流将逐渐降低。整个过程在常温操作，不能在低温操作。

16.当电泳示踪剂快到胶的边缘时停止电泳。

17.对 AU-PAGE 胶进行考染（本试剂盒不含考染相关试剂）：将 5 g 考马斯亮蓝R-250 溶解在 500 mL 脱色液（20%甲醛，7%乙酸）中，如果有不溶解的颗粒可以过滤去除，放入 AU-PAGE 胶后摇晃 1 小时。然后在脱色液

（20%甲醛，7%乙酸）中脱色直到调条带显现。注意：常见的碱性蛋白Histone 和鱼精-蛋白分子量都比较小，故不能使用固定步骤。

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