一管式点突变试剂盒模板长度为10-15 Kb的DNA（包括质粒的长度）。由于起始模板DNA很少，得到的扩增产物几乎都是突变DNA，故突变效率高达90%。

产品简介：

基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。本产品就是专门用于从含有野生型DNA插入片段的质粒DNA快速制备突变（包括点突变、插入突变和缺失突变）的试剂盒。

产品特点：

1.直接使用甲基化的质粒DNA作为模板，故模板必须是从dam+基因型的大肠杆菌宿主菌中制备的，常见的dam+菌株是DH5。某个菌株是不是 dam+需要询问菌株供用厂家。

2.有管式操作，整个过程只需要2小时。

3.模板DNA的需求量很少，只需要2 ng。

4.模板长度为10-15 Kb的DNA（包括质粒的长度）。由于起始模板DNA很少，得到的扩增产物几乎都是突变DNA，故突变效率高达90%。

5.实时检测PCR扩增，不需要电泳检测，节约宝贵的样本材料。

6.最终产物可以直接用于化学转化或电转化。

7.基于PCR扩增，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何DNA位点。

8.使用超保真酶，PCR过程中不会引入突变。

9.不但可以制备点突变，还可以制备1-3个碱基的缺失突变和插入突变。

10.本产品足够10 次点突变实验。

11.一管式点突变试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成份 规格包装

染料法 2×超保真PCR MasterMix100 L0.5 mL 本盖管

DpnI 限制性内切酶，10 U/L20 L0.5 mL 红盖管

超纯水 1 mL1.5 mL 蓝盖管

使用手册 1 份无

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

质粒 DNA、突变引物、细菌转化试剂。

使用方法：

一、引物设计

1.需根据突变位点周边序列设计两条错位互补引物，引物的 Tm 应该在 72℃左右，突变位点（可以是 1 个碱基，也可以是数个碱基）左右各有 14 个完-全互补的碱基对， 上引物和下引物的 3’端各多出 6 个碱基。下面为一个虚拟序列的两条错位互补引物，XXX 表示三个野生型碱基。NNN 表示希望突变后得到的碱基。阴影部分的序列

跟其互补链是完-全互补。

GCGATACGCAACTANNNGATCTCCATGCAGCTCATGC-3' 3'-TGCGACCGCTATGCGTTGATXXXCTAGAGGTACGTCG

2.引物的 GC 含量在 40％-60％之间，不能在 PCR 时形成引物二聚体。

3.引物必须 HPLC 纯化。

4.本方法是以质粒 DNA 为模板进行 PCR 扩增，因此质粒 DNA 完整性非常重要。如果质粒 DNA 有大量的 nick 或 gap（限制性内切酶酶切双链 DNA 不能发现某条单链 DNA 上是否有 nick 或 gap），则本方法的成功率将会降低。如果质粒宿主菌 DNase 活性没有去除干净，从中纯化的质粒 DNA 将会有更多 nick。如果模板不是新鲜制备的质粒 DNA，初步测试后效果不好，建议用自备的 E.coli DNA 连接酶对 nick 进行修复。操作请按E.coli DNA 连接酶使用手册进行。

二、一管式点突变 PCR（20 L 体系）

5.按下表设置两个 PCR 反应：

成分样本管阴性对照管模板 DNA2 ng-

染料法 2×超保真PCR MasterMix10 L10 L

自备引物一(10 M)1 L不加

自备引物二(10 M)不加1 L

补超纯水到终体积20 L20 L

6.放入荧光定量PCR 仪中按下面参数进行PCR：

步骤温度时间循环数

变性98℃3 分钟1 次

PCR98℃20 秒30 次，在

68℃时采集 SYBR

通道的荧

光信号

68℃30 秒

72℃30 秒/Kb（质

粒 DNA 长度）

注意：由于本产品是染料法实时 PCR，故尽管设置的循环次数是 30 次，但具体循环次数取决于扩增曲线。最佳循环数是样本管的扩增信号刚好进入平台区的循环次数，在进入平台区后，可在复性步骤手动停止 PCR。

7.按荧光定量 PCR 仪厂家提供操作流程进行溶解曲线分析。样本的 Tm 应该比对照高

（长处更对照管如果有 Tm，也是引物二聚体的 Tm），如果两者的 Tm 一样，则可能是样本扩增失败，需要电泳检测扩增产物的长度。

三、DpnI 酶消化和后续操作

8.在 PCR 反应管中加入 1 L DpnI 限制性内切酶，混匀后 37℃孵育 2 小时。

9.反应液可以直接取 1-2 L 用于化学转化和电转化，或者放-20℃保存备用。

10.转化后通常会得到 50 个-500 个菌落，95%是所需要的突变。而对照没有菌落。

选择我们的一管式点突变试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！