染料法实时易错 PCR 试剂盒可用于连续易错 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

产品简介：

易错PCR（Error-Prone PCR）是利用天然 Taq DNA 聚合酶不具有 3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP 浓度、不同 Mg2+浓度和有 MnCl2 存在）能够按较高的机率随机引入突变而设计。如果有适当的突变选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体，用于人工诱变。但是易错 PCR 在操作中最大的问题是最佳PCR 循环数的摸索，循环次数太多或太少，都得不到成形的突变 DNA 条带，影响后续的 DNA 回收和克隆步骤。

产品特点：

1.即开即用，十分简单方便。

2.可以实时监控 PCR 的进程，用户可以不需要任何摸索就能在最佳时间（荧光信号刚进入平台期）停止PCR，立即进行电泳，回收到突变 DNA。

3.配方经过精心优化，突变率稳定，用本试剂盒进行一次标准的易错 PCR 扩增实验一般会得到 6-7 个突变（对 1000 bp 的片段而言）。进行定向突变时每个基因有 2-6 个突变为最佳范围。

4.比体内基因突变更快捷简单，但如果在 PCR 引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。

5.可用于连续易错 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

6.只适用于扩增 1 kb 以下的产物，对于 1 kb 以上的产物，建议分段扩增。

7.本产品足够 100 次 30 L 体系的染料法实时易错PCR 反应。

8.染料法实时易错 PCR 试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成份规格包装

10×易错PCR Mix（含酶）300 L0.5 mL 红盖管

染料法易错 PCR 专用 dNTP300 L0.5 mL 黄盖管

易错PCR 增强剂300 L0.5 mL 白盖管

追加dNTP，0.5 mM300 L0.5 mL 本色管

易错PCR 专用 MnCl2300 L0.5 mL 绿盖管

使用手册1 份1 份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期为一年。

自备试剂

引物、DNA 模板、超纯水。

使用方法：

1.将自备的 PCR 引物稀释到 10 M。引物是决定易错 PCR 成败的关键因素，设计引物时要保证其 Tm 在 70℃，长度在 25-30 nt 之间，GC 含量在 45%-60%之间，3端 GC 含量低，并且没有发夹结构。

2.用自备引物和自备的常规PCR 试剂扩增制备易错 DNA 模板（常规 PCR 产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物， 因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错 PCR 引物扩增所得，在易错 PCR 扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。如果常规PCR 制备模板的引物和易错PCR 引物不同（类似巢式PCR） 则可以避免此问题，但需要合成两对引物。本试剂盒只适用于扩增 1 kb 以下的产物， 对于 1 kb 以上的产物，建议分段扩增。

3.将回收的 DNA 片段（模板）用水稀释到 1 ng/L 、10 ng/L 和 100 ng/L 三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，因为模板 DNA 为非突变 DNA， 扩增产生的 DNA 为突变 DNA，易错 PCR 体系跟常规 PCR 一样，最后会达到扩增平台，最终得到的扩增 DNA 的量是固定的，因此起始模板 DNA 使用量越大，则突变 DNA 在最终得到的总DNA 中的相对比例就越低。但模板太少又不容易扩增成功， 所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。

4.设置 30 μL 体系的易错 PCR 反应。在干净的 PCR 管中，分别加入下列成分。由于

Mn 离子容易跟其他成分发生沉淀反应，因此上机前最后加 MnCl2：

成分管 1管 2管 3

10×易错PCR Mix（含酶）3 L3 L3 L

自备 DNA 模板1 L

（1 ng/ L）1 L

（10 ng/ L）1 L

（100 ng/ L）

自备易错PCR 引物

(10 M each)各 1 L各 1 L各 1 L

易错PCR 增强剂3 L3 L3 L

染料法易错PCR 专用dNTP3 L3 L3 L

易错PCR 专用 MnCl23 L3 L3 L

补自备超纯水加到 30 L加到 30 L加到 30 L

5.立即按下列参数进行易错PCR：

步骤参数循环数

PCR 前变性94℃ 3 min循环 1 次

染料法实时易错PCR94℃ 1 min

循环 60 次，在 72℃ 时采集 SYBR Green I 通道的荧光信号

60℃ 1 min

72℃ 3-10 min

注：由于易错 PCR 含高浓度的镁离子，因此引物容易互为模板形成引物二聚体，因此使用 60℃为复性温度。在错误碱基掺入后，DNA 合成会暂时停滞，因此为了让DNA 合成继续，需要延长合成的时间到 3-10 分钟。易错 PCR 循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变 DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环次数过多，又得不到完成的 DNA 条带，没法进行后续的克隆。所以可以设置 60 次循环并不表示要完成 60 次，而是需要在荧光信号不再增长，进入平台期后立即停止易错 PCR 并进行电泳回收。

6.易错 PCR 结束后，立即电泳检测。如果扩增产物长度正确，则进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的 DNA 为模板， 再进行下一轮易错PCR。

7.如果没有扩增，则按下列操作进行追加 PCR。

8.在易错 PCR 管中，加入 3 L 追加dNTP 到 27 L 剩下的染料法实时易错 PCR 体系中，按下表进行追加实时PCR（chasing Real-Time PCR）。

9.追加实时PCR 荧光信号进入平台期后立即结束PCR，并不需要等到 20 个循环结束，并进行电泳检测。如果有 DNA 条带并且长度正确，则再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的 DNA 为模板，再进行下一轮易错 PCR。

10.如果没有预期大小的 PCR 产物，则需要分析原因。

选择我们的染料法实时易错 PCR 试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！