染料法实时可调易错 PCR 试剂盒可用于连续易错 PCR，只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

产品简介：

易错PCR（Error-Prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′ 校对功能

的特性，在一定条件下（如不同的dNTP 浓度、Mg2+浓度和 MnCl2 存在）能够以较高的机率随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库中筛选出所需突变体。很多时候，用户需要通过易错PCR 得到不同突变数的DNA 片段。为满足此需求， 本公司开发了可调易错PCR 试剂盒。在实用过程中，发现易错PCR 循环数很难优化， PCR 循环数过多或过少都得不到清晰的 DNA 条带用于后续回收和克隆。本公司继续改进并推出染料法实时可调易错PCR 试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，十分简单方便。

2.在荧光信号进入平台期即可终止循环，此时电泳就可以得到清晰的突变 DNA 条带， 不需要盲目摸索，节约大量的时间。

3.实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮 PCR 的突变率范围在 2-8 个突变

/1000 bp，更高的突变率可以通过多轮PCR 达到。

4.可用于连续易错 PCR，只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

5.可以扩增的 DNA 片段更长，以突变率设置为 0.1%以下的条件进行扩增时，靶分子长度可达 2 Kb，对于 2 Kb 以上的产物，建议分段扩增。

6.本试剂盒足够 100 次 30 L 体系的染料法实时易错PCR。

7.染料法实时可调易错 PCR 试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成份规格包装

5×染料法实时可调易错PCR Mix

（含dNTP）600 L1.5 mL 黄盖管

可调易错PCR 专用

Taq DNA 聚合酶（5 U/L）50 L0.5 mL 红盖管

可调易错PCR 专用 MnCl300 L0.5 mL 紫盖管

可调易错PCR 专用dGTP300 L0.5 mL 蓝盖管

10×可调易错PCR 追加dNTP300 L0.5 mL 本色管

使用手册1 份1 份

运输及保存

低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。

自备试剂

引物、DNA 模板、常规 PCR 试剂盒。

使用方法：

1.将引物稀释到 10 μM。引物也是决定易错 PCR 成败的关键因素，设计引物时要 

保证其 Tm 在 70℃，长度在 25-30 nt 之间，GC 含量在 45%-60%之间，3′  端

GC 含量低，并且没有发夹结构。

2.用自备易错PCR 引物和自备的常规PCR 试剂扩增制备易错DNA 模板（常规 PCR 产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错 PCR 引物扩增所得，在易错 PCR 扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。

3.将回收的 DNA 片段（模板）稀释到 100 ng/L、10 ng/L 和 1 ng/L 三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板 DNA 为非突变 DNA， 扩增产生的 DNA 为突变DNA，易错 PCR 体系最终 DNA 产量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，则突变 DNA 在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。

4.根据每 1000 bp 的预期突变数按下表确定 30 L 易错 PCR 体系中 MnCl2 和 dGTP 的用量（这是在模板 DNA 不超过 1 ng 的前提下的数据）。表中的 Mn 表示可调易错 PCR 专用的 MnCl2, dG 表示可调易错 PCR 专用的 dGTP：

5.设置 30 L 体系的可调易错PCR：第一次建议设置 3 个模板浓度。在 3 个干净的

PCR 管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR 专用 MnCl2：

成分模板用量 1模板用量 2模板用量 3

5×染料法实时可调易错PCR

Mix6 L6 L6 L

可调易错PCR

专用dGTP根据上步

用量表表选择根据上步

用量表选择根据上步

用量表选择

自备 DNA 模板1 L

（100

ng/L）1 L

（10 ng/L）1 L

（1 ng/L）

自备PCR 引物(10 M each)1 L each1 L each1 L each

可调易错PCR 专用

Taq DNA 聚合酶0.5 L0.5 L0.5 L

可调易错PCR

专用 MnCl2根据上步

用量表表选择根据上步

用量表表选择根据上步

用量表表选择

自备超纯水补水到 30 L补水到 30 L补水到 30 L

注意：5×染料法实时可调易错PCR Mix 冷冻后有沉淀，使用前可 65℃水浴加热溶解至透明无色使用。

6.按已经优化的常规PCR 条件进行染料法实时易错PCR：

注：由于易错 PCR 含高浓度的 Mg2+，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用60℃这种较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制 PCR。易错 PCR 一般不需要热启动，也不需要在易错 PCR 结束后做延伸处理。易错 PCR 循环次数越多，突变 DNA(扩增产物)与非突变 DNA(原始模板)的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环数过多或过少都不容易在电泳时形成清晰的 DNA 条带，没有条带就没法回收克隆。所以需要在荧光信号进入平台期后立即停止PCR。

7.染料法实时易错 PCR 结束后，取 3 L 电泳检查。

8.如果有预期大小的 PCR 产物，则用剩余的 PCR 产物进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。

9.如需要提高突变率，可以选择上轮易错 PCR 产物为模板，再进行下一轮易错 PCR。

10.如果第一轮易错 PCR 没有得到预期大小的 PCR 产物或者扩增 60 次也没有荧光信号，可以按下列操作进行一轮追加 PCR。

11.在 PCR 管中，加入 3 L 10×可调易错PCR 专用追加dNTP 到 27 L 电泳剩下的第一轮易错PCR 体系中（用了 3 L 去电泳），按下表进行追加 PCR（chasing PCR）。注意追加 PCR 只做 20 次循环。

12.追加PCR 结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以此轮追加PCR 的产物为模板，再进行下一轮易错 PCR。

13.如果没有预期大小的 PCR 产物，则需要分析原因。

选择我们的染料法实时可调易错 PCR 试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！