AFLP 试剂盒（EcoRI-MseI）提供 EcoRI-MseI 组合，适用于 GC 含量在 50%以上的基因组。对 GC 含量在 50%以下的基因组，需从本公司另外采购 EcoRI-TaqI 组合的 AFLP 试剂盒。

产品简介：

AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）原理是一种结合 RFLP 和 PCR 技术特点的一种分子标记分型技术，其原理如下：

产品特点：

1.一站式，足够 50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和 1500 次 AFLP PCR（30 μL体系计算），但不包括 DNA 纯化和带型分析试剂（如 PAGE 电泳试剂和银染试剂）

2.本产品提供 EcoRI-MseI 组合，适用于 GC 含量在 50%以上的基因组。对 GC 含量在 50%以下的基因组，需从本公司另外采购 EcoRI-TaqI 组合的 AFLP 试剂盒。

3.各种参数都经过优化，一次 PCR 所得 AFLP 片段数一般在 10-100 之间，可重复性好，误差小于 0.6%。

4.本产品适用于基因组在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物）。对于基因组在 50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid，BAC YAC 和 PAC 等），需要分别另购+0 型预扩增引物对和+2 型扩增引物。

5.AFLP 试剂盒（EcoRI-MseI）只能用于科研。

产品参数：

成份规格包装

AFLP 酶切-连接-预扩增相关成分50 次十孔盒

AFLP +3 型 EcoRI 引物系列8 条十孔盒

AFLP +3 型 MseI 引物系列8 条十孔盒

AFLP PCR 成分5 mL×6热封塑料袋

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

超纯水、Southern 级 DNA 纯化试剂，尿素-PAGE 电泳套装，银染试剂盒。

使用方法：

一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）

1.用户需要自备 50-500ng Southern 级别的基因组 DNA。DNA 酶切彻-底是 AFLP 成功的关键，所以最好先预实验以确保 DNA 能够被 EcoRI 和 MseI 内切酶彻-底切开。

二、 限制性内切酶酶切和 DNA-接头连接反应（本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的酶切-

连接反应）

2.在 0.2mL 离心管中设置 20μL 的限制性内切酶酶切反应：

3.轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温 2 小时酶切（若 PCR 仪器不带热盖，则必须加 50L自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同）。反应结束后 70℃保温 15 分钟灭活酶。

4.在体系中加入 20μL AFLP EcoRI-MseI 接头混合物和 1μL T4 DNA 连接酶，5U/L，轻柔混匀并短暂离心，20℃保温 3 小时让接头跟酶切 DNA 片段连接。第一次使用本试剂盒时，需要把本试剂盒提供的 1mL AFLP EcoRI-MseI 接头溶解液加入到 AFLP EcoRI-MseI 接头干粉管，涡旋震荡半分钟，短暂离心，然后再取用。没有用完的需要放-20℃保存。

5.反应结束后直接在 40μL 的连接反应体系中加入自备 360μL 超纯水，得到连接液 10倍稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。

三、 预扩增（本试剂盒足够 40 次 30μL 体系的预扩增反应）

6.在 0.2mL 离心管中设置 30μL 的预扩 PCR 体系。首-次使用本试剂盒时，需要在本试

剂盒提供的+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物干粉管中加入 100μL 自备超纯水，涡旋震

荡半分钟混匀，短暂离心后直接取用。没有用完的部分，需要放-20℃保存：

7.离心数秒，按下列参数进行 PCR 预扩增（注意：第一步是预合成，跟常规 PCR 不同）：预合成 72℃ 2 分钟，PCR 循环 20 次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）

8.取 10μL PCR 产物在 1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物应为大小在 100-1500bp 的模糊条带。本试剂盒的 2×PCR MasterMix 含上样液和示踪染料，故不需要额外加 Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于 50bp 的 DNA 片段。

9.在剩下的 20μL 预扩增反应液中加入 980μL 自备超纯水，相当于稀释 50 倍，所得 50倍 PCR 模板稀释液将直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。

四、选择性 PCR 扩增

10.制备引物：在本试剂盒提供的 8 只+3 型 EcoRI 引物干粉和 8 只+3 型 MseI 引物干粉中，每管分别加入 1100μL 自备超纯水，震荡混匀得 16 管引物母液。每管取 66μL引物母液与 1034μL 超纯水在 1.5mL 离心管中混合得 1100μL 每个引物的相应工作液，共 16 管引物工作液。

11.在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（第一次 PCR 时需要测试所有 8×8=64 种引物组合，需设置 64 个 PCR 反应。若已知哪个一种或几种引物组合适合，则可以直接使用选中的引物），下面以一种+3 型 EcoR I 引物和+3 型 Mse I 引物组合为例：

12.轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行 PCR：

温度时间

PCR

13 次循环94℃30 秒

65℃30 秒（每次循环递减 0.7℃）

72℃60 秒

PCR

23 次循环94℃30 秒

55℃30 秒

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